O que é PCR? A técnica de amplificação de DNA em cadeia, conhecida como PCR(do inglês Polymerase Chain Reaction), é amplamente utilizada nos laboratórios para obter múltiplas cópias (milhões) de uma região específica do DNA. Essa região pode ser qualquer segmento que desperte interesse para os pesquisadores, como um gene cuja função precisa ser compreendida ou um marcador genético usado por especialistas forenses para relacionar o DNA encontrado na cena do crime com os suspeitos.
O propósito principal da PCR é produzir uma quantidade suficiente da região de DNA desejada para que ela possa ser analisada ou empregada de outras maneiras. Por exemplo, o DNA amplificado por meio da PCR pode ser enviado para sequenciamento, submetido a eletroforese em gel para visualização ou clonado em um plasmídeo para experimentações futuras.
A PCR é aplicada em diversas áreas da biologia e medicina, abrangendo pesquisas em biologia molecular, diagnósticos médicos e até mesmo certos ramos da ecologia, veja abaixo mais detalhes sobre o que é PCR.
Taq Polimerase
Para saber o que é PCR, temos que ententer sobre a Taq Polimerase, assim como ocorre na replicação do DNA em um organismo, a reação em cadeia da polimerase (PCR) necessita de uma enzima DNA polimerase responsável por sintetizar novos filamentos de DNA, utilizando os filamentos já existentes como modelos. A enzima DNA polimerase comumente utilizada na PCR é conhecida como Taq polimerase, nome derivado da bactéria Thermus aquaticus, da qual foi isolada e que possui uma tolerância ao calor.
Primers de PCR
Outro tópico importante para entender o que é PCR são os primers de PCR. Da mesma forma como outras DNA polimerases, a Taq polimerase requer a presença de um primer, que é uma sequência curta de nucleotídeos, a fim de iniciar a síntese do DNA. Na reação de PCR, o pesquisador determina a região específica do DNA que será copiada ou amplificada, selecionando os primers apropriados.
Os primers de PCR são fragmentos curtos de DNA de cadeia simples, geralmente com cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Em cada reação de PCR, dois primers são utilizados e são projetados para se posicionar em ambos os lados da região alvo, ou seja, eles são projetados para se ligar às fitas opostas do DNA modelo, nas extremidades da região a ser copiada. Os primers se ligam ao molde de DNA por meio do emparelhamento de bases complementares.
Etapas
A reação de PCR requer a presença de Taq polimerase, primers, DNA molde e nucleotídeos (os elementos constituintes do DNA). Esses componentes são combinados em um tubo, juntamente com os cofatores necessários para a atividade da enzima, e submetidos a ciclos sequenciais de aquecimento e resfriamento, que permitem a síntese do DNA, o conhecimento dessas etapas é fundamental para saber o que é PCR.
Os passos fundamentais da PCR são os seguintes:
Em um tubo de microcentrífuga estéril, os seguintes reagentes são misturados.
- Modelo de DNA genômico (50ng – 250ng)
- Água deionizada
- Primer reverso
- Primer avançado
- Bases de nucleotídeos de DNA (dNTPs)
- Taq DNA polimerase
- Tampão de ensaio Taq (contém Tris-HCl, MgCl2 e KCl).
Desnaturação
Os reagentes acima são aquecidos a 94°C por 3-5 minutos. (A alta temperatura faz com que as ligações de hidrogênio entre as bases se quebrem e as fitas se separem em duas fitas de DNA simples).
Anelamento
A reação é agora resfriada a 50-65°C por 10-30 segundos. (Isso permite que os primers direto e reverso se liguem aos pedaços de DNA de fita simples por meio de ligações de hidrogênio).
Extensão
A reação agora é aquecida a 72°C por 5-10 minutos. (Esta é uma temperatura ideal para a Taq Polimerase se ligar ao primer e começar a adicionar os nucleotídeos para construir as fitas de DNA complementares).
As etapas acima são repetidas de 30 a 40 ciclos para produzir a sequência de interesse. O processo leva 1 minuto para copiar 1.000 bases de DNA. Todo o processo leva cerca de 3 a 4 horas, dependendo do comprimento do fragmento. O DNA original não é usado como modelo todas as vezes, pois o novo DNA feito em uma rodada pode servir como modelo para a próxima rodada de amplificação de DNA, a quantidade de etapas é importante para saber o que é PCR.
Aplicações
Além de saber o que é PCR, é ideal saber suas aplicações, o método de PCR é encontrado nos mais diversos campos. Por exemplo, a PCR é utilizada para amplificar genes relacionados a distúrbios genéticos a partir do DNA de pacientes, ou mesmo do DNA fetal em testes pré-natais. Além disso, a PCR pode ser empregada para detectar a presença de bactérias ou vírus de DNA no corpo de um paciente. Caso o patógeno esteja presente, é possível amplificar regiões específicas do seu DNA a partir de uma amostra de sangue ou tecido. Essas são outras áreas em que o PCR está presente:
- Biologia molecular para pesquisa
- Clonagem e sequenciamento de DNA
- Construção da filogenia relacionada ao DNA
- Análise da função do gene
- Diagnóstico de doenças hereditárias
- Amplificação do DNA antigo
- Impressão digital genética para análise forense
Equipamento necessário para PCR
Para a técnica de PCR ser bem sucedida, além do conhecimento sobre o que é PCR, um ambiente estéril se faz necessário, para isso são usadas cabines de PCR.
A Cabine Asséptica para PCR da Hipperquímica emprega a tecnologia para criar um ambiente seguro, com eficiência energética e livre de contaminantes. É ideal para uso com contaminantes não perigosos e quando é necessário acesso flexível à instrumentação no gabinete.
Veja também a importância da cabine pcr para seu laboratório.
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